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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù):922 更新時(shí)間:2023-06-30

一、準(zhǔn)備工作
1、實(shí)驗(yàn)器具與材料:
(1)移液槍?zhuān)?00ul、10ul
(2)吸頭:200ul、20ul
(3)吸頭臺(tái):放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)
(4)EP管1.5ml、100ul

2、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
塑料制品:(包括吸頭、EP管等)
送至高壓3次,試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。

3、試劑配制和準(zhǔn)備:
(1) 雙蒸水: 100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml蒸餾水,送至高壓,后分裝到幾個(gè)1。5mlEP管中,-20℃中保存?zhèn)溆谩?br/>(2) PCR中所需要的各種試劑

二、PCR時(shí)注意事項(xiàng):
佩戴一次性手套,同時(shí)避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。

三、PCR步驟
1、準(zhǔn)備100ul EP管
2、依次在管中加入:(50ul反應(yīng)體系)
ddH2O37.5ul×
10mM dNTP1ul×
10×PCR buffer5ul×
25mM MgCl2
(加之前要搖勻)3ul×
上游引物1ul×
下游引物1ul×
模板cDNA1ul

3、稍離心
4、100℃沸水浴1分鐘
5、趁熱加入Tag酶0.5ul(冰上操作)
6、再加入50ul液體石蠟封閉
7、10000rmp離心1分鐘
8、PCR條件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
進(jìn)行40個(gè)循環(huán),然后72℃ 10min 完后4℃保溫。
9、10000rmp離心5min
10、將下層水相轉(zhuǎn)入新的0.65mlEP管中,-20℃保存。

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